1. Внутри- и взаимозависимость фосфорилирования sMyBP-C в мотивах Pro / Ala rich и M Оценить внутризависимость...
2. Оценка уровней фосфорилирования mSer59, mSer62, mThr84 и mSer204 sMyBP-C в отношении здоровья, усталости и дистрофии
3. Изучение событий фосфорилирования, присутствующих в отдельных формах sMyBP-C

Внутри- и взаимозависимость фосфорилирования sMyBP-C в мотивах Pro / Ala rich и M

Оценить внутризависимость фосфорилирования в Pro / Ala-богатом мотиве sMyBP-C ( рисунок 1 ), мы выполнили анализы киназы in vitro с использованием ряда фосфоаблированных пептидов вместе с нашей панелью фосфо-специфических антител ( Рис. 2 ). В частности, мы использовали рекомбинантные пептиды дикого типа и фосфоаблированные, соответствующие NH2-концу m-isoform3 (GST-sMyBP-C NH2 aa1-285), поскольку он содержит все известные сайты фосфорилирования, включая mSer-59 и mSer-204. присутствует только в избранных вариантах ( рисунок 1 ). Мы обнаружили, что фосфорилирование mSer59 зависит от фосфорилирования mSer62, но не от mThr84 ( Рис. 3а (дорожка 3), учитывая снижение уровней фосфорилирования на 65% при мутации mSer62 в аланин ( Рис. 3а дорожка 2) по сравнению с контрольным белком дикого типа ( Рис. 3а пер. 1). Аналогично, фосфорилирование mSer62 или mThr84 зависит от фосфорилирования mSer59. Соответственно, мы наблюдали снижение уровня фосфорилирования mSer62 на 50% и 20% ( Рис. 3б , полоса 2) и mThr84 ( Рис. 3с , дорожка 2), соответственно, когда mSer59 мутирует в аланин. Кроме того, мы отмечаем снижение уровня фосфорилирования mSer62 на 30% ( Рис. 3б , полоса 3), когда mThr84 мутирует в аланин. Напротив, замена mSer62 аланином не влияла на уровни фосфорилирования mThr84 ( Рис. 3с , полоса 3) по сравнению с контрольными уровнями дикого типа ( Рис. 3б, в пер. 1).

Фигура 2: Характеристика четырех фосф-специфичных антител к α-sMyBP-C mSer59P, α-sMyBP-C mSer62P, α-sMyBP-C mThr84P и α-sMyBP-C mSer204P.

Анализы киназы in vitro использовали для определения специфичности каждого фосфо-антитела. NH2-концы sMyBP-C и NH2-концы fMyBP-C были получены в виде GST-слитых белков и обработаны PKA и / или PKC в зависимости от тестируемого фосфо-антитела. Необработанные и обработанные рекомбинантные белки разделяли с помощью стандартного SDS-PAGE и подвергали зондированию с помощью соответствующего фосфоспецифического антитела к mSer59 ( a ), mSer62 ( b ), mThr84 ( c ) и mSer204 ( d – e ). Примечательно, что ни одно из фосфо-антител не распознало необработанный NH2-конец медленной изоформы или обработанный PKA- или PKC NH2-конец быстрой изоформы или контрольного GST. Следовательно, эти антитела являются специфичными для их соответствующих фосфорилированных остатков, присутствующих в NH2-конце sMyBP-C.

Рисунок 3: Оценка внутри- и взаимозависимых событий фосфорилирования в пределах NH2-конца sMyBP-C.

In vitro киназные анализы были использованы для определения внутри- и взаимозависимости событий фосфорилирования sMyBP-C в богатом Pro / Ala мотиве и между богатым Pro / Ala мотивом и M-мотивом. Дикие типы и фосфоаблированные мутантные рекомбинантные белки, содержащие NH2-конец sMyBP-C, соответствующий m-изоформе 3, были получены в виде GST-слитых белков и инкубированы с PKA и / или PKC. Обработанные белки разделяли стандартным SDS-PAGE и подвергали зондированию с помощью соответствующего фосфоспецифического антитела к mSer59 ( a ), mSer62 ( b ), mThr84 ( c ) и mSer204 ( d ).

Далее мы изучили взаимозависимость фосфорилирования между областью, богатой Pro / Ala, и М-мотивом. Фосфорилирование mSer204 в М-мотиве через PKA снижается на 27%, 28% и 15% при mSer59 ( Рис. 3d , верхняя панель, полоса 2), mSer62 ( Рис. 3d , верхняя панель, полоса 3) и mThr84 ( Рис. 3d , верхняя панель, дорожка 4) мутированы в аланин соответственно по сравнению с диким типом ( Рис. 3d , верхняя панель, полоса 1). Точно так же фосфорилирование PKC mSer204 снижается на 15%, 24% и 19%, когда mSer59 ( Рис. 3d , нижняя панель, полоса 2), mSer62 ( Рис. 3d , нижняя панель, полоса 3) и mThr84 ( Рис. 3d дорожка 4 на нижней панели замещена аланином, соответственно, по сравнению с уровнями фосфорилирования дикого типа ( Рис. 3d , нижняя панель, полоса 1). Кроме того, PKA-опосредованное фосфорилирование mSer204 сильно зависит от одновременного фосфорилирования трех (известных) сайтов в богатом Pro / Ala мотиве, учитывая резкое снижение (50%) уровней его фосфорилирования, когда mSer59, mSer62 и mThr84 одновременно мутировал в аланин ( Рис. 3d , верхняя панель, полоса 5). Напротив, PKC-опосредованное фосфорилирование mSer204 не зависит от одновременного фосфорилирования сайтов с богатым мотивом Pro / Ala, поскольку не происходит снижения уровней его фосфорилирования, когда mSer59, mSer62 и mThr84 замещены аланинами ( Рис. 3d , нижняя панель, полоса 5). Таким образом, фосфорилирование PKA и PKC mSer204 в пределах М-мотива дифференциально зависит от индивидуальных и комбинаторных событий фосфорилирования в Pro / Ala-богатом мотиве. Примечательно, что фосфорилирование mSer59, mSer62 или mThr84 в Pro / Ala-обогащенном мотиве не зависит от фосфорилирования mSer204 в М-мотиве ( Рис. 3a – c переулок 4).

Изучение профиля фосфорилирования sMyBP-C в медленно сокращающихся мышцах подошвы на предмет здоровья, усталости и дистрофии

Чтобы изучить профиль фосфорилирования sMyBP-C in vivo , мы выбрали мышечную медленно сокращающуюся подошвенную мышцу в качестве модельной системы из-за обильной экспрессии нескольких вариантов sMyBP-C 8 , 10 , В частности, мы создали лизаты мышц подошвы, полученные от: 1. молодых (~ 2 месяца) и пожилых (~ 14 месяцев) мышей дикого типа, 2. мышей mdx по возрасту (модель дистрофин-дефицитной мышечной дистрофии), и 3. молодые (~ 4 месяца) мыши дикого типа и мышей mdx, подвергнутые протоколу острой усталости in vitro . Лизаты анализировали с помощью стандартного или фосфат-сродственного иммуноблоттинга SDS-PAGE. Учитывая наличие нескольких вариантов sMyBP-C, имеющих одинаковую молекулярную массу (126–131,5 кДа) 10 иммунореактивные полосы, обнаруженные в наших фосфат-аффинных блотах, могут соответствовать различным вариантам, фосфорилированным в разной степени, дифференциально фосфорилированным формам одного и того же варианта или их комбинации. Поэтому мы воздерживаемся от ссылки на них как на гиперфосфорилированные или гипофосфорилированные виды; вместо этого мы называем их видами с низкой, средней или высокой подвижностью.

Сначала мы исследовали общие уровни sMyBP-C с помощью стандартного иммуноблоттинга SDS-PAGE с использованием антитела α-pan-sMyBP-C. Мы обнаружили скромное, но значимое снижение уровней sMyBP-C в пожилом диком типе (~ 15%), но не в утомленной ткани молодого дикого типа, по сравнению с неутомимым молодым диким типом soleus ( Рис. 4а и а ' ). Более того, общие уровни sMyBP-C остаются неизменными в молодых утомленных и неутомленных образцах MDX, но значительно снижаются (~ 20%) в соответствующих старых мышцах MDX ( Рис. 4а и а ' ).

( а ) Вестерн-блот анализ белковых лизатов, разделенных стандартным SDS-PAGE и приготовленных из шести групп единственных мышц, включая: 1. молодых (~ 2 месяца) дикого типа (n = 7), 2. старых (~ 14 месяцев) диких тип (n = 4), 3. молодой (~ 4 месяца) дикий тип, подверженный утомлению (n = 3), 4. молодой (~ 2 месяца) MDX (n = 4), 5. старый (~ 14 месяцев) MDX (n = 4) и 6. молодые (~ 4 месяца) MDX подвержены усталости (n = 3). Образцы зондировали пан-специфическим антителом, распознающим все варианты sMyBP-C, α-pan-sMyBP-C и α-Hsp90 для обеспечения равной нагрузки. ( a ' ) Расчет процента (%) экспрессии общего sMyBP-C в различных группах мышц подошвы после нормализации к уровням экспрессии Hsp90 относительно процента (%) экспрессии sMyBP-C в молодой ткани дикого типа , который был установлен в качестве базового уровня. Значимость рассчитывали с помощью t-критерия Стьюдента (p <0,01). Символы * и # обозначают статистическую значимость по сравнению с тканью молодого дикого типа и молодой MDX , соответственно. ( c ) Разделение тех же белковых лизатов, которые использовались на панели ( a ), с помощью SDS-PAGE с аффинностью к фосфату с последующим иммунопробированием с антителом α-pan-sMyBP-C. Цветные точки обозначают иммунореактивные полосы низкой (красные и желтые точки), промежуточные (светло-зеленые, темно-зеленые, бирюзовые и темно-синие точки) и высокой (фиолетовые, розовые, светло-розовые, оранжевые и белые точки) подвижности.

Оценка состояния фосфорилирования sMyBP-C в молодых подошвенных мышцах дикого типа с использованием антитела α-pan-sMyBP-C и SDS-PAGE сродства к фосфату показала присутствие девяти различных видов, соответствующих дифференциально фосфорилированным формам вариантов sMyBP-C ( Рис. 4б ). Для простоты изложения мы обозначаем наблюдаемые иммунореактивные полосы цветными точками. Мы обнаружили две полосы низкой подвижности (красные и желтые точки), четыре промежуточные полосы подвижности (светло-зеленые, темно-зеленые, бирюзовые и темно-синие точки) и три полосы высокой подвижности (розовые, светло-розовые и оранжевые точки). В возрасте единственной мышцы дикого типа экспрессировалось одиннадцать различных фосфорилированных видов, разделяющих девять общих видов с молодыми образцами дикого типа и обладающих двумя новыми промежуточными (фиолетовая точка) и высокими (белая точка) формами ( Рис. 4б ). Напротив, утомляемость молодых подошвенных мышц дикого типа значительно изменила картину фосфорилирования sMyBP-C, о чем свидетельствует исчезновение трех промежуточных (бирюзовые, темно-синие и фиолетовые точки) и двух форм высокой (светло-розовые и коричневые точки) подвижности. ( Рис. 4б ).

Аналогичный анализ профиля фосфорилирования sMyBP-C в молодых и старых мышцах mdx soleus показал, что они экспрессируют те же основные виды, что и молодые мышцы soleus дикого типа, за следующими исключениями: как в молодых, так и в старых мышцах mdx soleus содержатся дополнительные виды промежуточной подвижности ( фиолетовая точка), которая также присутствует в выдержанной мышце подошвы дикого типа. Тем не менее, у молодой мышцы MDX soleus отсутствуют два вида с высокой подвижностью (оранжевые и белые точки), в то время как у пожилых mdx soleus мышцы нет одного вида с низкой подвижностью (красная точка) и одного вида с высокой подвижностью (светло-розовая точка) ( Рис. 4б ). Интересно, что профиль фосфорилирования sMyBP-C был значительно изменен в молодых утомленных мышцах mdx soleus по сравнению с неутомленными или утомленными молодыми мышцами mdx soleus дикого типа или без утомления, содержащими только четыре основных вида (обозначены красным, желтым, темно-зеленые и розовые точки) и отсутствие пяти-семи видов средней и высокой подвижности ( Рис. 4б ).

Оценка уровней фосфорилирования mSer59, mSer62, mThr84 и mSer204 sMyBP-C в отношении здоровья, усталости и дистрофии

Используя нашу панель фосфо-специфических антител ( Рис. 2 ) и стандартную SDS-PAGE, мы исследовали уровни фосфорилирования каждого идентифицированного фосфо-сайта в пределах NH2-конца sMyBP-C в мышцах soleus, полученных из шести групп животных, описанных выше. Как и ранее, мы рассматриваем молодые мышцы подошвы дикого типа в качестве основы для качественных и количественных сравнений.

Мы обнаружили, что все шесть образцов содержат варианты sMyBP-C, которые фосфорилированы в mSer59 ( Рис. 5а ). В частности, mSer59 кодируется альтернативно сплайсированным экзоном 5 и включается только в m-изоформу 3, соответствующую NH2-концу человеческих вариантов 1 и 2 ( рисунок 1 ) 11 , Уровни экспрессии вариантов sMyBP-C, фосфорилированных по mSer59, остаются неизменными в старых подошвенных мышцах дикого типа; однако они незначительно, но значительно увеличиваются у молодых утомленных диких типов (~ 8%) и утомленных молодых MDX (~ 4%), в то время как резко снижаются у утомленных молодых MDX (~ 33%) и старых MDX (~ 14%) ) мышцы подошвы, по сравнению с молодыми тканями дикого типа ( Рис. 5а ' ).

Вестерн-блот-анализ проводили с использованием стандартного SDS-PAGE и лизатов, полученных из шести групп единоличных мышц, описанных в Рис. 4 , Образцы исследовали с помощью антител, распознающих четыре известных фосфо-сайта sMyBP-C, включая α-sMyBP-C mSer59P ( a ), α-sMyBP-C mSer62P ( b ) α-sMyBP-C mThr84P ( c ) и α-sMyBP -C mSer204P ( d ). Уровни каждого фосфорилированного остатка, mSer59 ( a ' ), mSer62 ( b' ), mThr84 ( c ' ) и mSer204 ( d' ) в различных мышцах подошвы, рассчитывали как процент (%) экспрессии по сравнению с таковыми в молодых тканях дикого типа, как описано в Рис. 4 , Значимость рассчитывали с помощью t-критерия Стьюдента (p <0,01). Символы *, # и @ обозначают статистическую значимость по сравнению с тканями молодого дикого типа, молодого mdx и старого дикого типа, соответственно.

Аналогичный анализ белковых лизатов с антителами mSer62P, mThr84P или mSer204P показал наличие белков sMyBP-C, фосфорилированных в соответствующих местах в подошвенных мышцах во всех условиях ( Рис. 5б – г ). Количественный анализ уровней относительной экспрессии фосфо (p) mSer62-содержащих белков sMyBP-C показал, что по сравнению с молодыми тканями дикого типа, старыми дикими типами, молодыми mdx и старыми мышцами mdx soleus наблюдается снижение количества на ~ 39%, ~ 27% и ~ 26% соответственно ( Рис. 5b ' ). Напротив, количество p-mSer62-содержащих белков sMyBP-C остается неизменным в молодых утомленных мышцах дикого типа и mdx soleus по сравнению с молодой необработанной тканью дикого типа ( Рис. 5b ' ). Подобное количественное определение относительного количества p-mThr84-содержащих белков sMyBP-C показало, что они сходны между молодыми дикими типами и старыми дикими типами, молодыми MDX и старыми мышцами MDX soleus ( Рис. 5c ' ). Однако они значительно увеличиваются в утомленных мышцах подошвы дикого типа (~ 25%) и mdx (~ 24%) по сравнению с неутомленными тканями молодого дикого типа ( Рис. 5c ' ). Наконец, относительная количественная оценка p-mSer204-содержащих белков sMyBP-C продемонстрировала, что, хотя утомленные (либо дикого типа или mdx ) и дистрофические mdx (либо молодые, либо старые) мышцы soleus содержат уровни, аналогичные молодым тканям дикого типа, экспрессируется состарившаяся ткань дикого типа снижение (~ 13%) уровня таких видов ( Рис. 5d ' ).

Изучение событий фосфорилирования, присутствующих в отдельных формах sMyBP-C

Используя SDS-PAGE с сродством к фосфату и нашу группу фосфоспецифических антител ( Рис. 2 Затем мы рассмотрели события фосфорилирования, которые присутствуют в отдельных фосфо-видах sMyBP-C, обнаруженных с помощью нашего антитела α-pan-sMyBP-C ( Рис. 4б ). Иммунопробирование белковых лизатов, разделенных с помощью фосфат-сродства SDS-PAGE с антителом mSer59P, выявило присутствие двух основных видов: одного с низкой подвижностью (желтая точка) и одного с высокой подвижностью (розовая точка) эквивалентного содержания в молодой единственной мышце дикого типа ( Рис. 6а ). Они присутствуют в подошвенных мышцах всех исследованных групп, за исключением молодой утомленной ткани MDX , которая выражает только виды с высокой подвижностью ( Рис. 6а ). Интересно, что мышцы подошвы из отдельных групп животных экспрессируют дополнительные формы p-mSer59 sMyBP-C. В частности, состаренная мышца подошвы дикого типа содержит три дополнительных вида, включая одну полосу низкой подвижности (красная точка), одну промежуточную полосу подвижности (фиолетовая точка) и одну полосу высокой подвижности (белая точка) ( Рис. 6а ). Виды с низкой подвижностью, обозначенные красной точкой, также обнаружены в молодых утомленных мышцах подошвы дикого типа ( Рис. 6а ), тогда как вид промежуточной подвижности наблюдается исключительно в возрасте mdx soleus мышцы (темно-зеленая точка) ( Рис. 6а ).

Рисунок 6: Идентификация событий фосфорилирования, присутствующих в отдельных формах sMyBP-C.

Вестерн-блот-анализ с использованием SDS-PAGE-блоттинга сродства к фосфату белковых лизатов, полученных из шести групп мышц soleus, описанных в Рис. 4 были исследованы с четырьмя фосфоспецифическими антителами sMyBP-C: α-sMyBP-C mSer59P ( a ) α-sMyBP-C mSer62P ( b ) α-sMyBP-C mThr84P ( c ) и α-sMyBP-C mSer204P ( d ) , Цветные точки обозначают фосфо-виды sMyBP-C с низкой, средней и высокой подвижностью, идентифицированные с каждым антителом, и соответствуют тем, которые показаны на Рис. 4 ,

Использование антитела mSer62P выявило более сложный профиль. Мы наблюдали пять видов p-mSer62, содержащихся в молодых единичных мышцах дикого типа (красные, желтые, темно-синие, розовые и светло-розовые точки) с различной численностью. Примечательно, что некоторые виды, содержащие p-mSer62, проявляют аналогичную электрофоретическую подвижность с формами, содержащими p-mSer59. Пять p-mSer62-содержащих видов обнаружены в белковых лизатах, полученных из старых мышц дикого типа и молодых mdx soleus, которые также содержат дополнительный вид промежуточной подвижности (фиолетовая точка) ( Рис. 6б ). Напротив, утомленные молодые мышцы дикого типа или mdx и старые мышцы mdx soleus экспрессируют только некоторые из пяти основных фосфо-видов. В частности, утомленные ткани молодого дикого типа или mdx содержат три основные формы, соответствующие двум полосам низкой подвижности (красные и желтые точки) и одной полосе высокой подвижности (розовая точка) ( Рис. 6б ). Напротив, старая мышца mdx soleus выражает одну полосу низкой подвижности (желтая точка), две промежуточные полосы подвижности (темно-синие и фиолетовые точки) и одну полосу высокой подвижности (розовая точка) ( Рис. 6б ).

Аналогичный анализ с использованием антитела mThr84P показал наличие пяти основных видов, содержащих p-mThr84, в молодых точечных мышцах дикого типа (желтые, светло-зеленые, темно-синие, розовые и оранжевые точки), некоторые из которых проявляют аналогичную электрофоретическую подвижность с р- mSer59- и p-mSer62-содержащие формы ( Рис. 6с ). Такая же картина наблюдается в белковых лизатах, полученных из состаренной мышцы подошвы дикого типа, которая, кроме того, выражает виды с более низкой подвижностью (красная точка) ( Рис. 6с ). Исследование молодых и старых мышц mdx soleus показало сходный профиль экспрессии видов, содержащих p-mThr84, по сравнению с молодыми мышцами soleus дикого типа, за исключением того, что в молодой mdx ткани отсутствует вид с высокой подвижностью (оранжевая точка) ( Рис. 6с ). Интересно, что молодые мышцы дикого типа и mdx soleus, подверженные утомлению, экспрессируют только два и один малоподвижный вид, содержащий p-mThr84, соответственно ( Рис. 6с ). Более того, в то время как молодая утомленная мышца дикого типа также содержит полосу высокой подвижности (оранжевая точка), у молодой утомленной ткани MDX отсутствуют формы как средней, так и высокой подвижности ( Рис. 6с ).

Наконец, оценка профиля экспрессии p-mSer204-содержащих вариантов показала наличие четырех основных видов в молодой единственной мышце дикого типа, одного с низкой подвижностью (обозначено желтой точкой) и трех с промежуточной подвижностью (светло-зеленый, темно-зеленый). и бирюзовые точки) ( Рис. 6d ). Изучение количества и относительной численности p-mSer204-содержащих видов в старых подошвенных мышцах дикого типа показало наличие четырех основных видов, обнаруженных в молодых тканях дикого типа, а также дополнительную полосу низкой подвижности (красная точка) ( Рис. 6d ). Три из четырех видов, содержащих p-mSer204, также обнаруживаются после утомления молодых единственных мышц дикого типа ( Рис. 6d ). Примечательно, что относительная численность видов промежуточной подвижности, обозначенных темно-зеленой точкой, резко увеличивается в утомленной ткани молодого дикого типа по сравнению с необработанной мышцей молодого дикого типа ( Рис. 6d ). Подобно молодому дикому типу, молодые и старые мышцы mdx soleus экспрессируют одни и те же четыре вида, содержащие p-mSer204, в то время как молодые утомленные мышцы mdx soleus экспрессируют только одну p-mSer204-содержащую форму промежуточной подвижности (темно-зеленая точка) ( Рис. 6d ).

Похожие

Комментарии